曾文如，王东伟，邵晓奇
（广东药科大学中医药研究院，广东广州 510006）
心力衰竭是临床发病率和病死率较高的常见疾病之一，流行病学调查结果显示，由心肌肥厚导致的慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是多种心血管疾病的共同结局，也是心血管疾病死亡的主要原因，并且其发病率逐年上升，严重危害人类生命健康[1-2]。由于慢性心力衰竭的发病机制十分复杂，且不同动物模型的心脏功能变化和触发的信号通路也不尽相同。因而，CHF 动物造模限制了抗心衰药物的研发进展[3-4]。小鼠是最常用的模拟人类疾病模型的实验动物，小鼠心衰模型的建立有多种方法[5-6]，目前主要采用两种方法：化学药物诱导和物理手术。异丙肾上腺素（isoproterenol,ISO）是一种非选择性β 受体激动剂，通过激动心脏β 受体，使心率加快，心肌耗氧量增强，引起心肌损伤，其发病机制主要与炎症反应、氧化应激和凋亡有关，可直接或间接作用于心肌组织，造成心肌轻度损伤，引起心肌肥厚，引起心力衰竭[7-8]。ISO 诱导心衰模型，具有简单、易操作、无创伤、重复性高等优点，但其缺点是建模时间不一致，因个体反应性而存在差异。主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）是通过定量缩窄主动脉，模拟心脏在长时间压力和容量负荷下，转变为心力衰竭所致的心肌肥厚[9-10]。TAC 手术能模拟由于后负荷增加而导致的心肌肥厚，以及失代偿转变的慢性心衰过程，具有重复性高的优点，但对实验人员的技术要求严格、学习周期长、手术后死亡率高[11]。本研究采用C57BL/6 小鼠TAC 或IS O 制备小鼠CHF 模型，旨在研究两种小鼠模型在超声心动图、炎症肥大指标和病理等方面的差异，以及不同方法制备的CHF 动物模型进行心功能改变和特点的探讨，更好地模拟临床上不同发病原因的心衰患者，为慢性心衰的治疗策略提供新的角度。
1.1 实验动物
C57BL/6 小鼠40 只，SPF 级，雄性，8 周龄，体质量（20±2）g，购于广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2020-0051。小鼠实验前适应性饲养1 周，饲养于SPF 级动物房，伦理委员会批准号：gdpulacspf2017277。
1.2 药物、主要试剂、仪器
盐酸异丙肾上腺素（规格：5 g，货号SIGMAI5627，Sighna 公司）；
异氟烷麻醉剂（规格：100 mL，货号R510-22-10，瑞沃德公司）；
叔戊醇（规格：100 mL，货号S140673-100 mL，上海阿拉丁）；
医用超声耦合剂（规格：250 mL，货号TM-100 型，天津津亚）；
脱毛膏（规格：2 5 g，货号X S-0 0 6 1，广州科荣生物有限公司-薇婷）；
氯化钠注射液（规格：500 mL，货号LS-366966-1，广州源满生物科技有限公司）；
3M 医用胶带（规格：1.2 cm 宽3 卷/组，货号ZJ2652，江西奥斐特商贸有限公司）；
Vevo2100 小动物超声影像系统（Canada Visual Sonics）；
3R210-06气体麻醉机（Midmark）；
SI-0256涡旋混匀器（VORTEX-GENIE）；
FA2204 十万分之一分析天平（上海市安亭电子仪器厂）。
1.3 动物模型的建立
1.3.1 TAC 模型 随机将小鼠分为假手术组和TAC手术组，每组各10只，小鼠进行异氟烷气体麻醉后，置于水平固定鼠板上，将27G 垫针置于右头臂动脉与左颈总动脉之间，并将主动脉弓结扎，随后抽出缩窄针，用碘伏擦拭创面，逐层关闭胸腔，缝好皮肤，并置于暖光灯旁[6]。
1.3.2 ISO 诱导模型 随机将小鼠分为正常对照组、ISO 组，每组各10 只。小鼠皮下注射剂量8 mg/mL ISO（0.1 mL/20 g），连续注射14 d，对照组小鼠给予等剂量的生理盐水，不作其他处理[7]。
1.4 超声心动图及相关指标的检测
通过超声检查B型、M型切面，定量分析心脏功能指标。观察舒张期和收缩期的室间隔厚度（IVSd、IVSs）、左心室内径（LVIDd、LVIDs）、左心室壁厚度（LVPWd、LVPWs）、射血分数（EF%）、短轴缩短分数（FS%）和E/A（E 峰：左室舒张早期快速充盈的充盈峰，A 峰：舒张晚期心房收缩充盈的充盈峰）的变化。
1.5 炎症因子的检测
小鼠TAC 术后12 周和ISO 给药14 d 后，通过qRT-PCR 实验检测小鼠心脏组织中IL-1β、IL-18、TNF-α等炎症因子的表达水平。
1.6 标本采集与处理
TAC术后12周，连续注射ISO 2周后，收集小鼠心脏，将其中一部分冷冻于-80 ℃，用于后续实验，其余心脏组织浸于4%（φ）多聚甲醛中，用于后续病理组织学分析。
1.7 病理组织学检测
通过HE 和Masson 实验观察TAC 手术和ISO给药小鼠心脏组织中的心肌细胞的排列、炎症浸润和纤维化情况。
1.8 统计学分析
采用GraphPadPrism7 软件进行分析，两组之间的差异比较采用非配对T检验，多组间采用单向方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 超声观察
2.1.1 TAC小鼠超声心动图观测 在TAC术后第0、2、4、6、8、10、12 周，通过超声心动图验证TAC 造模手术成功，并进行心脏功能检测。超声心动图显示，TAC 手术12 周心脏出现收缩和舒张功能障碍（图1）。
图1 Sham组和TAC小鼠组超声结果图Figure 1 Ultrasound findings in sham and TAC mice groups(n=10)
2.1.2 TAC 小鼠超声心动图观察不同时间点心脏的结构和功能变化情况 结果显示，小鼠心室壁厚度和心腔宽度随着时间不断变化，心室壁由薄变厚再变薄，心室腔由宽变窄再变宽，说明小鼠心脏功能从代偿期向失代偿期转变，逐渐发展为心力衰竭。EF%结果显示心脏收缩功能先升高后降低（图2）。
图2 TAC小鼠0～12周M-Mode胸骨旁长轴切面超声图及EF%随时间变化情况Figure 2 Changes of M-Mode parasternal long axis ultrasound and EF% with time in mice at 0-12 weeks(,n=10)
2.1.3 ISO 小鼠超声心动图观测 小鼠腹腔注射ISO 后第0、14 天，通过超声心动图对小鼠进行心脏功能检测，ISO 小鼠在造模后发生了明显的心室扩张，心室壁变薄，并且E/A 峰比值下降，结果表明模型组小鼠心脏发生了结构变化和功能障碍（图3）。
图3 Sham组和ISO小鼠超声结果图Figure 3 Ultrasound results of sham mice and ISO mice(n=10)
2.2 TAC模型与ISO模型小鼠一般指标比较
2.2.1 两种模型肥大指标比较 与假手术组和正常对照组小鼠相比，TAC 手术组和ISO 给药组小鼠的心脏质量与体质量的比值（HW/BW）和心脏质量与胫骨长度比值（HW/TL）明显升高。通过观察HE 局部放大图发现ISO 和TAC 小鼠心脏肌肉长度较Sham组显著增加，表明小鼠的心脏发生肥大。实验结果表明，HW/TL 和HW/BW 在两种模型中变化基本一致，说明两种造模方法都具有比较好的重复性和可靠性（图4）。
图4 两组模型小鼠的HW/BW、HW/TL及HE染色、乳头肌放大图Figure 4 HW/BW,HW/TL and HE staining,enlarged papillary muscle of two groups of model mice(,n=10)
2.2.2 两种模型心脏功能指标比较
与假手术组小鼠相比，TAC 术后12 周或ISO 给药14 d 后EF%、FS%下降，E/A 峰比值下降；
左心室壁变薄同时心腔容积明显增大，心脏发生明显的舒张功能障碍。两种手术后的降低程度基本一致，说明两种造模方法都能诱导心衰（图5）。
图5 两组模型小鼠EF%、FS%和E/A峰比值Figure 5 EF%,FS%and E/A peak ratio of two groups of model mice(,n=10)
2.2.3 两种模型心脏室壁变化比较
假手术组小鼠心腔无明显扩张，室间隔厚度（IVS）和LVPW、LVID均在正常范围内；
与假手术组小鼠相比，TAC 手术后其心脏收缩能力、室间隔厚度、左心室室壁厚度均有明显上升，心腔微幅扩张，表现出典型的向心性肥厚。并且TAC 手术12 周后左心室壁变薄，心腔容积明显增大。而ISO给药小鼠的心脏功能与对照组小鼠相比，存在明显的功能紊乱并显示出心室容积增加，室间隔厚度和左心室壁厚度有小幅下降的趋势，这说明ISO组的小鼠存在心脏舒张功能障碍。TAC 小鼠与ISO 小鼠相比，IVS、LVPW 在收缩舒张变化不大，LVID 在舒张收缩时有显著差异性（P＜0.01），这说明两种不同模型诱导肥厚或纤维化的起始部位可能存在差异性（图6）。
图6 两组模型小鼠IVS、LVPW、LVIDFigure 6 IVS,LVPW and LVID of two groups of model mice(,n=10)
2.3 两组模型小鼠心脏组织病理学观察
HE 染色结果显示，假手术组和正常对照组小鼠的心肌细胞排列整齐，细胞核无明显皱缩现象，细胞形态正常；
而TAC 组和ISO 组小鼠的心肌细胞排列紊乱，细胞核变大，细胞体积明显增大，并伴随明显的炎症细胞浸润。Masson染色结果表明，假手术组和正常对照组小鼠的肌纤维呈鲜红色，而TAC组小鼠的心脏组织出现大面积的蓝色阳性信号，发生明显的胶原纤维沉积，ISO 模型小鼠心脏组织中也观察到类似的现象。通过对比发现ISO诱导小鼠发病部位为心室内壁以及右心室，而TAC 诱导的模型小鼠发病部位主要为乳头肌及左心室，尽管最终计算出相同的心功能参数，两种模型的致病机理和分子机制可能不同（图7）。
图7 两组模型小鼠HE染色和Masson染色结果图Figure 7 HE and Masson staining results of two groups of model mice(n=3)
2.4 两组模型小鼠心脏组织中炎症反应的变化
与假手术组小鼠相比，TAC IL-1β、IL-18、TNF-α的mRNA表达水平升高。ISO组小鼠心脏中也观察到类似的IL-1β升高情况，但IL-18、TNF-α趋势表达相反（图8）。
图8 两组模型小鼠炎症相关因子IL-1β、IL-18、TNF-α的表达Figure 8 Expression of inflammatory related factors IL-1β,IL-18 and TNF-α in two groups of model mice(n=10)
小鼠动物模型是模拟研究临床疾病发病机理、开展药物研制的重要依据。由于人口老龄化加剧，心血管发病率和病死率逐年上升，严重危害人类的生命健康。心血管疾病引起的心力衰竭往往是患者死亡的主要原因。心力衰竭是指心脏的收缩或舒张功能障碍，使心脏输出量减少，从而导致心脏血液循环障碍[12]。目前，慢性心力衰竭及其发病机制尚未完全明确，建立和评价小鼠心衰模型意义重大。本研究通过TAC 和皮下注射ISO 建立慢性心衰模型，通过超声心动图对不同造模条件下小鼠心脏功能的变化进行评估，并通过HE染色、Masson染色和qRT-PCR 实验对炎症和纤维化相关标志物的变化进行检测。
超声心动图检测是评价心脏功能的指标之一。本研究连续12 周对TAC 诱导的小鼠进行心功能检测，反映小鼠心室壁厚度、心腔宽度随时间变化等特点。常用HW/BW、HW/TL 的变化来评价心脏肥大的程度[13-14]，TAC 和ISO 的造模方式都对小鼠心肌肥大有明显的诱导作用。但根据Masson 染色的结果，TAC 诱导心肌纤维化的好发部位是乳头肌，ISO 则是心室内壁。由于TAC 是模拟心脏后负荷增加，还原高血压引起的心力衰竭，所以这种方法比较符合临床上充血性心力衰竭的病理变化过程。而ISO 腹腔注射引起的心脏衰竭，尽管操作简单，但其发病机理复杂，尚需深入研究。研究表明心脏逐渐积累的炎症是导致心脏衰竭的关键因素之一，PCR 结果显示，炎症因子IL-1β在两个模型中的表达明显增加，而ISO 诱导的模型中IL-18、TNF-α的表达明显减少，考虑到两个模型诱导的时间不同，纤维化部位不一致可能是炎症信号通路不同所致。推测在心肌肥厚模型中起主导作用的致病因子为IL-1β，但其具体的分子机理仍需进一步探究。炎症是心脏多种急慢性疾病的共同致病因素。本研究表明，不同诱因引起的炎症类型和炎症因子不同，需要密切结合研究内容进行课题设计。
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