杨蕾，韩彦莎，仪慧兰
（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）
二氧化硫（SO2）是普遍存在的大气污染物，主要来源于煤炭、石油等化石燃料的燃烧和含硫矿物的加工［1］。大气SO2污染会抑制植物光合作用，干扰呼吸过程，引起叶面损伤，甚至植株死亡［2-3］。研究表明，高浓度的SO2可诱导植物体内活性氧（ROS），如超氧阴离子（O2−·）、过氧化氢（H2O2）等的大量产生［3-4］，提高胞内ROS水平。一定量的ROS可诱发植物抗逆基因表达，提高植株逆境适应能力，但过量ROS会引发氧化胁迫和氧化损伤［5］。
SO2主要由气孔进入植物体，经水解生成SO32−。胞内 SO32-可氧化为 SO42−后储存，SO32−和SO42−可经硫同化途径产生半胱氨酸（Cys）。植物硫同化过程从SO42−开始，根部从土壤中吸收的SO42−可被ATP硫酸化酶（APS）还原为SO32−，SO32−经亚硫酸盐还原酶（SiR）催化生成硫化氢，而后在O-乙酰丝氨酸裂解酶（OASTL）作用下合成有机硫化合物Cys。Cys是甲硫氨酸、谷胱甘肽和其他含巯基多肽与蛋白质的前体，这些胞内巯基通过多种途径参与维持细胞的氧化还原平衡［6］。逆境胁迫时硫同化途径增强，胞内含硫抗氧化物水平提高，有益于植物的抗氧化防御［7-8］。其中，谷胱甘肽是普遍存在于植物细胞中的抗氧化小分子，还原型谷胱甘肽（GSH）可直接还原O2−·、羟基自由基（·OH−）等ROS分子，还能与谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽硫转移酶（GST）等一起，清除胞内活性氧、协助细胞解毒［9］；
谷胱甘肽还原酶（GR）可将氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为GSH，维持较高水平的GSH［10］。
谷子是我国北方地区广泛种植的粮食作物。近年来，因其具有耐瘠薄、抗旱、高光效及基因组小、生命周期短等优势，谷子已逐渐成为研究C4植物生理特性的新模式物种［11］。前期研究发现，一定浓度的SO2熏气可激活谷子幼苗抗氧化系统，提高植株渗透调节能力［12］，但谷子对SO2胁迫的适应机制尚不清楚。本文以谷子幼苗为实验材料，从生理生化和基因表达等方面研究SO2暴露对谷子硫同化作用的影响，为揭示谷子逆境响应机制提供依据。
1.1 植物培养
将谷子（Setaria italica L.）“长农 44号”的种子在2.5%次氯酸钠溶液中消毒5 min，无菌蒸馏水冲洗3次。湿纱布包裹催芽后，播种于长、宽、高均为10 cm的育苗盆中，每盆10颗种子，置培养室中培养。培养条件为：温度（23±1） ℃，相对湿度 50%～60%，光/暗周期16 h/8 h，光照强度 150 μmol·m−2·s−1。
1.2 SO2暴露
根据我们前期的研究结果［12］，选用10 mg·m−3和30 mg·m−3的SO2浓度。将苗龄 15 d的谷子幼苗10盆置于体积1 m3（长、宽、高均为1 m）的密闭箱中，依据K2S2O5+2HCl→2KCl+H2O+2SO2原理产生SO2，并利用甲醛吸收-副玫瑰苯胺分光光度法测定SO2浓度，维持熏气箱内SO2浓度稳定［13］。对照组箱体内为自然空气，放置相同的植株数量。
1.3 生物量和生理生化指标检测
SO2处理一定时间后，取谷子幼苗20株，测定幼苗地上部分生物量及叶组织中的相关生理和分子指标。
1.3.1 叶绿素含量测定
取谷子叶片用96%的乙醇提取叶绿素，分光光度法测定叶绿素a/b的含量，以叶绿素a和叶绿素b之和表示叶绿素含量［14］。
1.3.2 抗氧化酶活性测定
取谷子叶片加入50 mmol·L−1的磷酸盐缓冲液，研磨制浆，12 000 g离心后取上清，检测其中的酶活性。采用Brychkova等的方法［15］检测 SiR 酶活性，用 Müller-Schüssele等的方法［16］测定 GR 酶活性，以 1 min内氧化 1 mmol·L−1NADPH所需的酶量记为一个酶活力单位（U）；
采用CDNB比色法测定GST酶活性［17］，以1 min内吸光值降低0.1所需的酶量作为一个酶活力单位（U）；
参照 Wendel［18］的方法测定GPX酶活性，以1 min内分解1 μmol GSH所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。
取谷子叶片加入 20 mmol·L−1的 Tris-HCl研磨，12 000 g离心，取上清，参照 Hasan等［19］的方法测定OASTL酶活性，将1 min内生成1 μmol Cys所需的酶量作为一个酶活力单位（U）。
取不同提取液，采用Pierce BCA Protein As⁃say Kit（Thermo，USA）检测各测试样品中的蛋白质含量，用于酶活力计算。
1.3.3 Cys、GSH和GSSG含量测定
取谷子叶片，加入 25 mmol·L−1Tris-HCl研磨匀浆，12 000 g离心后取上清，用酸性茚三酮法测定Cys含量［20］，用谷胱甘肽试剂盒（A061-1，南京建成生物工程研究所）测定GSH和GSSG含量。
1.4 基因表达水平检测
用植物总RNA快速提取试剂盒（Dakewe，China）提取新鲜叶组织总RNA，采用Prime⁃Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，Japan）反转录合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq™ II PCR Kit（Takara， Japan）对目的基因进行荧光定量PCR扩增，扩增程序为：95 ℃，3 min；
95 ℃，5 s；
55 ℃，30 s；
72 ℃，30 s。以 Si⁃Actin 为内参，采取 2–ΔΔCt方法计算处理组与对照组基因表达的差异［21］。所用引物序列如表1所示。
1.5 数据统计与分析
所有的实验数据均来自3次独立的取材测试，实验结果表示为均值（X）±标准误差（SE），采用SPSS17.0统计分析软件对结果数据进行分析，独立样本T检验分析处理组和对照组的差异显著性，用*表示P<0.05，**表示P<0.01。
2.1 SO2对谷子幼苗生物量和叶绿素含量的影响
谷 子 幼苗暴露于 10 mg·m−3的 SO2时，植株地上部分生物量与对照组无明显差异（P>0.05；
图1（a）），叶绿素含量在暴露72 h时显著降低（P<0.05；
图 1（b））。暴露于 30 mg·m−3的SO2时，植株地上部分生物量在暴露前期与对照无明显变化（P>0.05；
图1（a）），暴露72 h后显著下降（P<0.05；
图 1（a））；
叶绿素含量呈相同趋势（图1（b））。以上结果表明，SO2对谷子幼苗的影响与浓度和作用时间有关，30 mg·m−3SO2短期暴露抑制植株生长，因此，后续选用 30 mg·m−3SO2研究谷子幼苗对 SO2胁迫的响应。
2.2 SO2对谷子幼苗硫同化作用的影响
幼苗暴露于30 mg·m−3的 SO2后，硫同化途径关键酶OASTL和SiR的酶活性提高，OASTL酶活性在暴露24 h后显著提高，SiR酶活性在暴露72 h时显著高于对照（P<0.01；
图2（a）、2（b））。硫同化产物 Cys的含量在 SO2暴露24 h和72 h时显著增加24.1%和46.7%（P<0.01；
图 2（c）），与 OASTL 酶活性改变呈相同趋势。硫同化途径关键基因SiOASTL、Si⁃SiR和SiAPS的转录水平在SO2暴露组发生改变，SiOASTL转录上调（P<0.01；
图 2（e）），Si⁃SiR在暴露72 h时明显上调（P<0.01；
图2（d）），而SiAPS在SO2暴露24 h和72 h时表达下降（P<0.05；
图 2（f））。以上结果表明，SO2暴露能使谷子幼苗硫同化作用增强，含硫抗氧化物含量提高；
而同期SiAPS表达下调，可能抑制 SO42−转化为 SO32−，减少 SO32−积累。
2.3 SO2对谷子幼苗谷胱甘肽循环的影响
暴露于 30 mg·m−3的 SO2后，谷子叶片总GSH含量显著高于对照（P<0.05；
图3（a））；
还原型GSH和GSSG的含量在熏气前期与对照组无明显差异（P>0.05），熏气72 h后GSH的含量显著高于对照（P<0.01；
图 3（b）），GSSG的含量显著降低（P<0.05；
图 3（c）），致使GSH/GSSG比值显著升高（P<0.01；
图3（d））。与此同时，GR酶活性在SO2暴露期间显著高于对照（P<0.05；
图3（e））；
GST酶活性在熏气前期与对照组无明显差异（P>0.05），熏气72 h后显著提高（P<0.01；
图 3（f））；
GPX酶活性在暴露期间与对照无明显变化（P>0.05；
图3（g））。SO2暴露组总GSH含量提高说明SO2暴露组谷子幼叶GSH合成增加，而GR活性增加能促进谷胱甘肽循环中GSSG还原为GSH，维持胞内较高水平的还原型GSH，有益于胁迫条件下细胞的氧化还原平衡和细胞稳态。
SO2进入植物体后水合生成 SO32−，SO32−可经硫同化途径生成Cys，也可被氧化为SO42−，同时产生ROS［22］。氧化胁迫是SO2暴露影响植物生长发育的主要原因，谷子幼苗经30 mg·m−3SO2暴露72 h时植株地上部分生物量下降，与SO2暴露诱导叶面气孔关闭［12］、叶绿素含量下降继而影响光合作用有关，也是植株氧化胁迫的反映。植物暴露于高浓度SO2时组织细胞中ROS 水平提高，抗氧化防御体系被激活［6，22］。SO2暴露时拟南芥植株硫同化作用增强，同化产物Cys增加，GSH含量、GPX和GST活性提高，参与植株抗氧化应答［7-8］，本研究在谷子幼苗中得到了相似结果，并证实SO2熏气组谷子幼苗硫同化基因SiSiR、SiOASTL表达上调。本结果与文献报道的干旱、重金属胁迫诱导小麦和拟南芥植株硫同化作用增强，GSH合成增加［23-24］相一致，表明非生物胁迫能够诱导植物硫同化作用增强，激活的硫同化作用在植物逆境适应中发挥了重要作用。其中，细胞内的Cys、GSH及含巯基的多肽和蛋白质，在细胞氧化还原平衡中有无可替代的作用［25］。
谷胱甘肽是细胞内重要的抗氧化小分子，可直接清除ROS分子，或通过GSH-ASA循环和 GSH-GSSG 循 环 清 除 ROS［26］。
在 GSHGSSG循环中，GST将脂质过氧化物转化成无毒醇，GPX将H2O2还原成水［27］，同时GSH被氧化为GSSG；
而GSSG可经GR催化还原为GSH。在GSH-GSSG循环过程中，活性氧自由基被清除，循环相关酶的活性提高可加速胞内活性氧的清除。此外，GST作为一种细胞解毒酶，可结合细胞内的有毒代谢产物，并协助其从胞内排出，从而使细胞解毒。SO2诱导谷子GST活性增高，能够促进胁迫期间胞内有害物质的排出；
GR活性增高可加速细胞的谷胱甘肽循环，进而提高GSH含量，维持较高GSH/GSSG比值，高效清除ROS。SO2胁迫促进拟南芥组织中Cys、GSH及游离巯基增加［7］，与本文结果一致，说明植物可通过调整硫还原作用提高细胞抗氧化能力，增强植株的逆境适应性。
研究还发现，SO2胁迫可诱导谷子叶片中SiAPS基因表达下调（图2（f）），从而抑制硫同化过程中SO42−还原成SO32−，这是叶绿体内SO32−过量形成的反馈抑制，能减少SO32−的积累，使胞内更多的无机硫以SO42−形式存在。SO42−对细胞的毒性远小于 SO32−，因此 SO42−还原的抑制对维持细胞稳态有积极的作用，可增强谷子幼苗对SO2胁迫的耐受性。
本文报道了谷子硫同化过程对SO2胁迫的响应，发现了SO2对硫同化产物形成的促进作用，即SO2暴露可激活谷子植株硫同化途径，提高硫同化产物Cys和含硫抗氧化物GSH的水平，有助于提升组织细胞的抗氧化能力；
与此同时，SO2暴露抑制了 SO42−还原为 SO32−的过程，可减少有害性分子SO32−的积累，保护细胞免于伤害（图4）。
