李亚晶，陈 雷，李明轩，王华伟，邓洪儒
首都医科大学附属复兴医院血管外科，北京 100045
静脉血栓栓塞症是常见的心血管疾病，包括深静脉血栓形成和肺栓塞（pulmonary embolism，PE），其影响着多达5%的患者[1]。由于检测手段和技术的提高，虽然PE的住院率呈上升趋势，但病死率保持稳定或呈下降趋势[2-3]。下肢深静脉血栓形成后的血栓脱落并堵塞肺动脉是PE发生的常见机制。中医药在心血管疾病的防治方面具有丰富的经验并取得了良好的效果，在缩短治疗时间、控制病情进展、减少相关并发症等方面充分显示出独特的优势。网络药理学根据系统生物学理论，使用生物信息学和网络分析的方法对生物系统进行分析，其在中医药领域的应用主要强调对信号通路的多途径调节[4]。通过网络药理学可以发现所有生物活性成分或单药治疗疾病的靶点、功能和机制。丹参酮ⅡA是从丹参中分离得到的主要活性化合物，具有保护心脏、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等多种生物活性[5]。本研究运用网络药理学和分子对接的技术，构建可视化网络，探讨丹参酮ⅡA治疗PE的分析机制，揭示其相关生物学靶点和信号通路，为临床用药提供参考，现报道如下。
1.1 丹参酮ⅡA相关靶点筛选
通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）数据库[6]以“Tanshinone ⅡA”为关键词，设置条件为“Chemical name”搜索丹参酮ⅡA的相关靶点。从PubChem数据库[7]获取丹参酮ⅡA的分子结构，以SDF格式存储其三维结构，然后将SDF文件上传至PharmMapper数据库[8]和Swiss Target Prediction数据库[9]，获得丹参酮ⅡA的相关靶点。从Uniprot蛋白质数据库[10]中获得人类基因信息，通过对比人类基因信息，将相关数据库中获得的蛋白名称翻译成相应的基因名称，获得最终的丹参酮ⅡA相关靶点。
1.2 PE相关靶点筛选
通过GeneCards数据库、人类在线孟德尔遗传数据库（online Mendelian inheritance in man，OMIM）、治疗目标数据库（therapeutic target database，TTD）、DrugBank数据库、DisGeNET数据库、药物遗传学和药物基因组学知识数据库（pharmacogenetics and pharmacogenomics knowledge base，PharmGKB），以“pulmonary embolism”为关键词搜索PE相关的靶点，并合并6个数据库得到的结果，去除重复的靶点，得到PE相关靶点。对未转化的靶点进行人工搜索，并去除重复的基因，最后得到所需的PE相关靶点基因。
1.3 丹参酮ⅡA治疗PE核心靶点基因的筛选
得到PE和丹参酮ⅡA的相关靶点后，通过Venny 2.1.0软件得到丹参酮ⅡA与PE的交叉靶点，并将其导入STRING数据库[11]构建蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络，置信参数设置为0.9，然后将PPI数据传输至Cytoscape 3.8.2软件[12]中进行可视化分析，并应用CytoHubba插件筛选得到排名靠前的10个核心靶点基因。
1.4 基因本位（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析
采用R语言包中的“clusterProfiler”“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“ggplot2”“pathview”对核心基因的GO功能、KEGG通路进行富集分析和可视化。GO包括分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular component，CC）和生物过程（biological process，BP）。对于富集分析，P值和Q值截止点均设定为0.05。绘制气泡图和柱状图对输出结果进行可视化。
1.5 分子对接
通过分子对接分析预测和获得蛋白质与小分子之间的结合力、相互作用力。应用ChemBio3D Ultra 14.0软件将丹参酮ⅡA三维结构的SDF格式转换成mol2格式。通过UniProt数据库搜索核心基因，在蛋白质结构数据库（protein data bank，PDB）[13]中获得目标基因的三维结构，并以PDB格式保存。通过PyMOL软件去除受体三维结构中的水分子和小分子配体，然后使用AutoDockTools对受体进行氢化处理，确定活性口袋。在AutoDock-Vina软件[14]中，活性口袋中心区域的数值被用于分子对接，并通过PyMOL软件进行可视化，同时记录对接结合能。结合能小于0表示丹参酮ⅡA和核心靶点基因可自发结合，目前认为结合能≤-5.0 kcal/mol（1 kcal＝4.18 kJ）的药物分子与靶点之间具有较好的结合活性。
2.1 丹参酮ⅡA与PE的相关靶点
通过TCMSP、PubChem、PharmMapper、Swiss Target Prediction、Uniprot蛋白质数据库筛选出372个丹参酮ⅡA的无重复靶点基因，而从GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank、DisGeNet、PharmGKB数据库中筛选出1135个无重复的PE相关基因。
2.2 丹参酮ⅡA治疗PE的PPI网络构建和核心基因
通过Venny 2.1.0软件分析得到丹参酮ⅡA和PE的交叉靶点，并得到丹参酮ⅡA治疗PE的131个交叉靶点（图1A）。利用STRING数据库在PPI网络模型图中描述了肺栓塞和丹参酮ⅡA的共表达基因（图1B），将PPI网络数据输入Cytoscape 3.8.0软件，得到由103个节点和371条边组成的网络（图1C右）。利用Cytoscape 3.8.0软件中的CytoHubba插件得到一个由10个节点和36条边组成的关键子网络（图1C左）。这10个基因可能是丹参酮ⅡA治疗PE的药理机制的核心靶点，分别是类固醇受体辅助活化因子（steroid receptor coactivator，SRC）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11（protein tyrosine phosphatase non-receptor type 11，PTPN11）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、信号转导及转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、TP53、AP-1转录因子亚单位（AP-1 transcription factor subunit，JUN）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，PKB1，又称AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、热休克蛋白90AA1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）。
图1 丹参酮ⅡA治疗PE核心靶点的筛选
2.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
对10个关键的核心基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。通过GO功能富集分析共得出1316个GO项目，其中，1182个GO项目富集于BP中，主要涉及erb-b2受体酪氨酸激酶（erb-b2 receptor tyrosine kinase，ERBB）信号通路、端粒酶活性的调节、器官生长、生殖结构发育、生殖系统发育、乳腺上皮发育、蛋白质运输、对机械刺激的反应、负离子转运的正调节、肌肉细胞增殖等；
48个GO项目富集于CC中，涉及富ficolin-1颗粒内腔、富ficolin-1颗粒、分泌颗粒腔、细胞质泡腔、囊泡腔、凹陷、主轴、质膜细胞质侧的外源成分、等离子膜筏、质膜细胞质侧等；
86个GO项目富集于MF中，涉及DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、激素受体结合、磷酸酶结合、磷蛋白结合、泛素蛋白连接酶结合、蛋白酪氨酸激酶结合、MAPK活性。KEGG通路分析共得出110条信号通路，这些核心基因参与了多个重要的致病过程，包括癌症、脂质与动脉粥样硬化、内分泌抵抗、病毒感染等。图2和图3显示了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的结果图。利用Cytoscape 3.8.0软件创建了丹参酮ⅡA-PE-GO（BP、CC、MF）-KEGG-核心靶点的可视化网络图（图4）。
图2 丹参酮ⅡA治疗PE的GO功能富集分析图
图3 丹参酮ⅡA治疗PE的KEGG通路富集分析图
图4 丹参酮ⅡA-PE-GO（BP、CC、MF）-KEGG-核心靶点的可视化网络图
2.4 丹参酮ⅡA与靶点的分子对接分析
将10个核心靶点基因（SRC、PTPN11、ESR1、STAT1、TP53、JUN、AKT1、MAPK1、HSP90AA1、MAPK14） 与 丹参酮ⅡA（配体）进行分子对接，结果显示，丹参酮ⅡA与10个核心靶点基因的结合活性均较高，丹参酮ⅡA可以很容易地进入并结合到其核心靶点基因的活性位点（图5）。SRC、PTPN11、ESR1、STAT1、TP53、JUN、AKT1、MAPK1、HSP90AA1、MAPK14与丹参酮ⅡA对接的结合能见表1。
表1 丹参酮IIA与靶点的分子对接分析结果
图5 核心基因与丹参酮ⅡA的分子对接
血管损伤、静脉血流延迟、静脉血流呈高凝状态等正常的静脉生理紊乱会增加静脉血栓栓塞症的发生风险。下肢深静脉血栓形成引发的PE是静脉血栓栓塞症的严重并发症，而PE会引起肺动脉高压，致使免疫系统失衡，进而抑制免疫系统，引发全身及肺组织的炎性反应，造成肺损伤[15]。
丹参酮ⅡA是一种具有代表性的天然黄酮类化合物，具有以下8个方面的作用：（1）具有保护心脏、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成、抗肿瘤、抗炎和抗病毒等多种生物活性；
（2）丹参酮ⅡA能够增加脂多糖、百草枯、海水、博莱霉素、胰腺炎、误吸诱导的急性肺损伤动物的存活率，减轻肺组织病理学变化和肺水肿[16-20]；
（3）通过抑制促炎细胞因子、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6的表达抑制肺部炎症；
（4）通过抑制活性氧、黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）和肌醇依赖酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）的表达减轻氧化应激反应；
（5）就机制而言，通过抑制血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）和血管紧张素1-7（angiotensin 1-7，Ang 1-7）的表达预防急性肺损伤的发生[19]；
（6）可以通过上调核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号通路的表达预防氧化应激反应[16]；
（7）丹参酮ⅡA通过抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3- hydroxy kinase，PI3K）/AKT/叉头框蛋白O1（forkhead box protein O1，FoxO1）信号通路上调B细胞淋巴瘤因子-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和下调Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X，BAX）、Caspase 3的表达，从而抑制凋亡[17]，凋亡在急性肺损伤中发挥着重要作用；
（8）通过抑制水通道蛋白1（aquaporin 1，AQPl）和水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）的过度表达抑制肺水肿和肺损伤的发生[21]。
有研究报道了丹参酮ⅡA的多种有益效果，包括内皮功能的修饰、斑块稳定性的改善、血栓形成的抑制和局部炎性反应的缓解[22]。丹参酮ⅡA被证实可减少巨噬细胞的迁移和抑制血管平滑肌细胞的凋亡，进而降低胆固醇酯的相对含量，增强血管内皮稳定性[23]。丹参酮ⅡA的有益效果与其对血小板沉积和聚集的抑制作用有关[24]，特别是可通过调节微管蛋白乙酰化水平和抑制细胞外信号调节激酶2（extracellular signal-regulated kinase 2，ERK2）磷酸化来抑制血小板聚集和降低血栓素浓度[25]。其他抗凝机制归因于丹参酮ⅡA能够降低凝血级联反应不同阶段的促凝血活性，包括组织因子活性和凝血酶活性[26]。
本研究表明，丹参酮ⅡA治疗PE有效，其核心治疗靶点包括SRC、PTPN11、ESR1、STAT1、TP53、JUN、AKT1、MAPK1、HSP90AA1、MAPK14。利用GO富集和KEGG通路分析发现多种信号通路，主要包括癌症、脂质与动脉粥样硬化、内分泌抵抗、病毒感染等相关的信号通路。本研究将丹参酮ⅡA作为配体，通过与核心基因进行分子对接发现，丹参酮ⅡA可以很容易地进入并结合到其核心靶点基因的活性位点，表明丹参酮ⅡA可能通过作用于SRC、PTPN11、ESR1、STAT1、TP53、JUN、AKT1、MAPK1、HSP90AA1、MAPK14治疗PE。在这些核心靶点中，AKT1是促炎因子，存在于内皮细胞中，其与细胞代谢、凋亡、血管生成、维持血管完整性密切相关，而血管稳定性的破坏是血栓形成的重要条件[27]。近年来，有研究表明AKT1在血小板聚集和稳定血栓等方面起重要作用[28]。SRC是凝血反应和炎性反应中重要的信号分子，其具有促进血小板活化与聚集的作用[29]。就目前而言，其他基因在参与机体凝血与血栓形成等方面的认知尚不足，需要进一步的研究。
综上所述，基于网络药理学和分子对接分析能够揭示丹参酮ⅡA治疗PE的核心靶点和信号通路，不仅能够为PE及其相关并发症的进一步临床研究提供思路，还可能有助于阐明丹参酮ⅡA治疗PE的药理机制，为开发针对PE的新疗法提供新的可能性。
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