仇碧茹 侯琳 张丽 牛婷婷 宋军莹
(1 青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系,山东 青岛 266071; 2 青岛大学药学院; 3 青岛大学附属医院乳腺外科)
神经母细胞瘤起源于交感神经系统［1-2］,常用的治疗手段有化疗、手术切除、高剂量化疗联合自体干细胞挽救(ASCR)等［3］。然而临床常用的化学合成药物具有毒副作用大、治疗效果不佳且伴有明显的骨髓抑制等缺点［4］,从而限制了这些化学合成药物的临床应用。
吲哚-2,3-二酮(ISA)是天然存在于自然界的吲哚类化合物,是我国独创Ⅰ类天然抗癌新药靛玉红的单体结构,具有抗病毒、抗肿瘤等作用［5-7］。Janus激酶(JAK)属于酪氨酸激酶家族,由TYK2、JAK1、JAK2、JAK3 4个成员组成。JAK2作为多种生长因子和细胞因子激活信号通路的调节器,在多种细胞类型中高表达［8］。研究发现,激活JAK2/STAT3信号通路可促进多种人类肿瘤如胶质母细胞瘤、肺癌、肝癌等的发生和进展［9-10］,阻断该通路可抑制细胞增殖,并诱导肿瘤细胞的凋亡［11-13］。本研究通过探讨ISA对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞抗肿瘤的作用及机制,旨在为神经母细胞瘤的治疗提供有益的参考价值。
1.1 试剂与抗体
神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中科院上海细胞库,ISA购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;GAPDH抗体、p-JAK2抗体、p-STAT3抗体、Bax抗体、Bcl2抗体购买于英国Abcam公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海翌圣生物科技股份有限公司;CCK-8试剂盒、PI染色液、牛血清白蛋白(BCA)蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司。
1.2 细胞培养
使用DMEM高糖培养基+体积分数0.10的胎牛血清+青链霉素混合溶液(100 kU/L青霉素和100 mg/L链霉素)配置完全培养基,然后将SH-SY5Y细胞养于含有完全培养基的细胞培养瓶中,并置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温培养箱中培养,待细胞进入对数生长期后,进行后续实验。
1.3 CCK-8实验检测ISA对SH-SY5Y细胞活力的影响
将对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于96孔板中,每孔1 000～2 000个细胞,向每孔中加入含不同浓度 (0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、800 μmol/L) ISA的完全培养基,放入37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养48 h后,向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液继续孵育2 h。酶标仪测量波长450 nm的各孔吸光度(A)值,计算不同浓度下细胞活力及半致死浓度(IC50值)。
1.4 平板克隆实验检测ISA对SH-SY5Y细胞克隆形成能力的影响
将对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于6孔板中,每孔约500个细胞,置于培养箱中培养24 h后,分别加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D组),培养箱中培养1～2周,孔中可见克隆形成时终止培养。甲醇固定细胞15 min,弃固定液,结晶紫染色细胞10 min,洗去染色液,自然风干。肉眼计数克隆数,计算克隆形成率。
1.5 划痕实验检测ISA对SH-SY5Y细胞迁移能力的影响
将对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于内含完全培养基的6孔板中,每孔约50 000个细胞,当细胞融合度约为90%时,用200 μL枪头垂直于培养板进行划痕。用PBS清洗细胞3次后,每孔加入2 mL无血清培养基,并分别加入含有0、50、100及200 μmol/L ISA(A～D组)无血清培养基继续培养。于第0、12、24和48小时时显微镜下拍照,计算划痕面积。
1.6 ISA对SH-SY5Y细胞凋亡的影响
将对数生长期的SH-SY5Y细胞,接种于6孔板中,每孔约10 000个细胞,分别加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D组),培养48 h后。按Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的操作要求,用流式细胞仪进行细胞凋亡的检测,并计算细胞凋亡率。
1.7 ISA对SH-SY5Y细胞周期的影响
将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞培养于细胞培养瓶中,分别加入含有0、50、100、200 μmol/L ISA(A～D组)的完全培养基,置于培养箱中培养48 h后,按照PI染色试剂盒说明书对细胞进行处理,用流式细胞仪进行细胞周期的检测,计算G1期细胞构成比。
1.8 Western blot 实验检测ISA对SH-SY5Y细胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白相对表达量的影响
收集终浓度为0、50、100、200 μmol/L ISA处理48 h后的SH-SY5Y细胞(A～D组),RIPA裂解液处理后提取总蛋白,BCA法测蛋白浓度后进行电泳,PVDF转膜后用封闭液室温封闭2 h,TBST清洗3次,一抗孵育过夜,TBST清洗3次,二抗孵育1 h。按ECL发光液说明书孵育PVDF膜,成像仪显影并拍照。以GAPDH的条带结果为内参照,将目的蛋白与内参的条带进行比较,以计算目的蛋白的相对表达量。
1.9 统计学方法
2.1 ISA对SH-SY5Y细胞活力的影响及其IC50值
CCK-8实验结果显示,以终浓度为0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、800 μmol/L的ISA处理SH-SY5Y细胞48 h以后,SH-SY5Y细胞的细胞活力分别为(100.00±0.73)%、(97.56±0.58)%、(95.10±0.55)%、(90.00±1.04)%、(86.62±0.39)%、(84.29±0.77)%、(80.26±0.93)%、(69.97±0.91)%、(62.71±1.04)%、(57.48±1.04)%、(40.33±1.04)%、(22.68±0.79)%,随着ISA浓度的递增,SH-SY5Y细胞的活力逐渐下降(F=1 632.62,P<0.05)。计算得到ISA作用SH-SY5Y细胞48 h后的IC50值为300 μmol/L,小于IC50值的浓度对细胞没有毒性,故后续的实验选用的ISA浓度为0、50、100、200 μmol/L。
2.2 各组SH-SY5Y细胞集落形成能力的比较
平板克隆实验的结果显示,A～D组的克隆形成率分别为(100.00±1.99)%、(79.88±1.32)%、(52.82±1.09)%、(25.75±1.08)%,随着ISA浓度的增加,SH-SY5Y细胞的集落形成能力逐渐下降(F=1 038.21,P<0.05),各组间两两比较差异均具有显著性(t=11.91～46.43,P<0.05)。
2.3 各组SH-SY5Y细胞迁移能力的比较
重复测量设计的方差分析结果显示,组别、时间及组别和时间的交互作用对SH-SY5Y细胞迁移能力均具有明显影响(F组别=379.00,F时间=291.00,F组别*时间=2.84,P<0.05);单独效应分析结果显示,随着时间的延长,A～D组SH-SY5Y细胞的迁移能力逐渐增强(F=94.83～153.77,P<0.05),同一组内不同时间点两两比较差异均具有显著性(t=5.90～23.14,P<0.05),不同时间点各组之间整体比较差异有显著性(F=39.87～222.00,P<0.05),各组之间两两比较差异也具有显著意义(t=3.57～34.28,P<0.05)。见表1。
表1 各组SH-SY5Y细胞迁移率比较
2.4 各组SH-SY5Y细胞凋亡率的比较
检测结果显示,A～D组的凋亡率分别为(4.29±0.17)%、(6.16±0.21)%、(8.74±0.34)%、(17.01±0.51)%,随着ISA浓度的升高,细胞的凋亡率逐渐升高(F=557.71,P<0.05),各组间两两比较差异均具有显著性(t=9.06～33.41,P<0.05)。
2.5 各组SH-SY5Y细胞中G1期细胞构成比比较
检测结果显示,A～D组的G1期细胞构成比分别为(35.33±1.17)%、(42.59±0.13)%、(54.04±0.21)%、(58.09±0.13)%,随着ISA浓度的升高,SH-SY5Y细胞G1期细胞构成比显著性增高(F=632.38,P<0.05),各组间两两比较差异具有显著性(t=8.67～123.68,P<0.05)。
2.6 各组SH-SY5Y细胞中Bax、Bcl2及p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量比较
实验结果显示,A～D组Bax的蛋白相对表达量随ISA浓度的增高明显升高(F=464.50,P<0.05),而p-JAK2、p-STAT3、Bcl2蛋白相对表达量随ISA浓度的升高明显降低(F=286.56～541.13,P<0.05),各组间两两比较,上述4种蛋白的表达差异均具有显著性(t=5.75～50.46,P<0.05)。见表2。
表2 各组SH-SY5Y细胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl2、Bax蛋白的相对表达量比较
肿瘤侵袭和转移是一个高度有序、非随机、器官选择性的过程,涉及一系列复杂的步骤［14］。神经母细胞瘤的相关性死亡大多数发生于淋巴结和骨骼转移［15］。因此,抑制癌细胞侵袭和迁移对于肿瘤的治疗至关重要［16］。
随着细胞生物学、肿瘤基因学研究的不断深入,寻找作用效果好、毒副作用低、特异性强的新型抗肿瘤药物已成为当今抗肿瘤药物研究的重要发展方向。近年来,全球的目光纷纷聚集于能够直接靶向作用肿瘤细胞、对正常细胞损伤较小的天然小分子化合物类药物(如长春碱、长春新碱等)的研究。ISA作为天然吲哚类化合物［16］,具有多种药理学活性,如神经保护、抗菌和抗病毒等活性［17］。既往研究发现,ISA还具有促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用［18-20］。
JAK2是一种广泛表达的非受体蛋白酪氨酸激酶,可作为多种生长因子(包括白细胞介素、干扰素、生长激素、促红细胞生成素和瘦素)和细胞因子受体激活的信号通路的调节器。JAK2可由多种细胞因子(包括生长激素、干扰素γ)、生长因子(包括EGF和PDGF)和GPCR配体激活,并参与细胞的增殖与迁移。
JAK2激活STAT3后,被激活的STAT3转移到细胞核中,进一步激活各种靶基因的转录［21-23］。STAT3作为众多致癌信号通路的汇合点,在肿瘤形成中发挥着重要的作用。大量证据表明STAT3可参与细胞凋亡以及肿瘤细胞的增殖和侵袭［1］。既往的研究表明,在神经母细胞瘤中,肿瘤细胞的迁移可能与p-STAT3的表达下降有关［24］。p-STAT3是STAT3的活化形式,异常的STAT3信号传导是肿瘤恶性进展的关键过程,并由JAK2诱导［24］。
针对神经母细胞瘤增殖能力强、易转移的特性,本研究对ISA在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中的抑制作用进行了深入探究。通过CCK-8实验检测不同浓度ISA对SH-SY5Y细胞活力的影响,结果显示随着ISA浓度的升高,SH-SY5Y细胞活力逐渐下降,计算得出ISA作用于SH-SY5Y细胞48 h的IC50值为300 μmol/L,小于IC50值的浓度对细胞没有毒性,因此选用0、50、100、200 μmol/L为后续实验的浓度。本研究采用平板克隆实验、划痕实验分别检测ISA对SH-SY5Y细胞克隆形成能力和迁移能力的影响,结果显示不同浓度的ISA处理SH-SY5Y细胞后,随着ISA浓度的增加,细胞的克隆形成率和迁移率均明显下降,这表明ISA显著抑制了SH-SY5Y细胞的克隆形成能力和迁移能力。当肿瘤细胞的凋亡机制被破坏,细胞生长不再受到限制时,肿瘤便会随之发生和发展。若能够重新激活肿瘤细胞的凋亡机制,就有望实现治疗肿瘤的目标。细胞周期在抗癌药物筛选中是一个主要的关注点,细胞生长需要经历G1、S、G2与M期,细胞从G1进入S期为关键点,决定了细胞周期能否继续。为了探究ISA对SH-SY5Y细胞的凋亡和细胞周期的影响,本研究采用Annexin V-FITC/PI试剂和PI染色流式细胞仪分别检测ISA对SH-SY5Y细胞的凋亡和细胞周期的影响,结果显示不同浓度的ISA作用于SH-SY5Y细胞后,随着ISA浓度的增高,SH-SY5Y细胞的凋亡率明显升高,且G1期细胞构成比显著增高。Bax和Bcl2同属于Bcl2家族,Bax为促细胞凋亡的因子,而Bcl2为抗细胞凋亡因子,均为参与细胞凋亡的重要生物学因子。JAK2、STAT3作为JAK2/STAT3通路的重要成员,p-JAK2以及p-STAT3的表达水平变化可反映ISA能否通过此信号通路发挥抑制肿瘤发生与发展的作用。本研究Western blot实验结果表明,SH-SY5Y细胞中的Bax的蛋白相对表达量随ISA浓度的增高明显升高,而p-JAK2、p-STAT3和Bcl2蛋白相对表达量随ISA浓度的升高明显下降,表明ISA可以促进Bax蛋白表达,同时抑制p-JAK2、p-STAT3、Bcl2蛋白的表达。
综上所述,本研究结果显示,ISA对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖与迁移具有显著的抑制作用,其抑制作用可能是通过JAK2/STAT3通路实现。ISA有望为神经母细胞瘤的临床治疗提供新的思路,具有乐观的应用前景。
作者声明：仇碧茹、侯琳、张丽参与了研究设计;仇碧茹、牛婷婷、宋军莹参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突。
猜你喜欢母细胞结果显示克隆克隆狼环球时报(2022-09-20)2022-09-20成人幕上髓母细胞瘤1例误诊分析中国临床医学影像杂志(2022年6期)2022-07-26顶骨炎性肌纤维母细胞瘤一例国际放射医学核医学杂志(2021年10期)2021-02-28浙江：诞生首批体细胞克隆猪今日农业(2020年24期)2020-12-15髓外硬膜内软骨母细胞瘤1例中国临床医学影像杂志(2019年1期)2019-04-25预防小儿母细胞瘤，10个细节别忽视中国生殖健康(2019年9期)2019-01-07最严象牙禁售令中国报道(2018年2期)2018-04-20第四次大熊猫调查结果显示我国野生大熊猫保护取得新成效绿色中国(2016年1期)2016-06-05抗BP5-KLH多克隆抗体的制备及鉴定兽医导刊(2016年12期)2016-05-17Galectin-7多克隆抗体的制备与鉴定现代检验医学杂志(2015年4期)2015-02-06
