马甜甜 朱翠雯 李东旭 张晓洋 喻明霞
胃癌（gastric cancer，GC）在全球癌症发病率中排名第五，在癌症相关死亡率中排名第三。在全球范围内，每年有超过70 万人死于该病［1］。胃癌的发生归因于各种因素，包括幽门螺杆菌感染、生活方式因素（如酒精、吸烟）和遗传风险因素等［2］。在所有胃癌病例中，胃腺癌（stomach adenocarcinoma，STAD）是最常见的亚型，STAD 是一种典型的异质性恶性疾病，具有多种亚型和临床表现［3］。虽然胃癌患者采用了手术联合化疗的多学科治疗方法，但预后仍不理想，总生存期（overall survival，OS）不足12 个月［4］。因此，识别有效的生物标志物对胃癌的早期诊断、治疗及预后至关重要，针对每个患者量身定制治疗方案的精准医疗将提高临床疗效。
增强子是一种远端调控DNA，通过与靶基因启动子相互作用来增强靶基因的转录［5］。最近发现增强子也转录非编码RNA，称为增强子RNA（enhancer RNA，eRNA）。eRNA 是从转录增强子区域由RNApollII 转录的顺式作用元件，属于lncRNA 的一种［6］。人类细胞中已经发现了数以万计的eRNAs，其中许多被证明在介导靶基因激活的转录回路中起着重要作用［7］。越来越多的研究表明eRNA 在癌症早期诊断、治疗与预后预测中的可行性与有效性。Zhang 等人［8］发现eRNAID2-AS1与膀胱癌的预后和免疫治疗相关。Zhu 等人［9］发现eRNAELOVL2-AS1在三阴性乳腺癌中表达下调，ELOVL2-AS1的迁移抑制作用可能是通过调控纤毛或ELOVL2的关键靶基因介导的。本研究探索了胃癌患者生存相关的eRNA 及其靶基因，发现RASSF8-AS1与胃癌的临床病理特征、患者总生存期等显著相关，可能作为胃癌早期诊断、治疗的生物标志物。
1.1 数据的下载与处理
在UCSC Xena 数据库（https：//xena.ucsc.edu/）中下载33 类肿瘤的表达数据、生存数据和临床数据。将患者的临床信息和基因表达数据进行匹配，删除信息不全的数据。对基因表达数据进行归一化处理，获得了特异性增强子转录的eRNAs 列表。
1.2 eRNA 生存分析筛选及与靶基因相关性分析筛选
将表达数据中胃癌相关的eRNA 表达量与生存数据合并，获得eRNA 表达矩阵与生存信息合并的表格，筛选出目标基因RASSF8-AS1。根据RASSF8-AS1的表达量的中位数，将胃癌患者分为高、低表达两组，利用Kaplan-Meier 法比较两组之间生存的差异。同时进行相关性分析过滤，获得RASSF8-AS1的靶基因RASSF8。
1.3 RT-qPCR法测定RASSF8-AS1和RASSF8水平
使用TRIzol 试剂从人胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞AGS 中提取总RNA，将RNA 反转录为cDNA。每组设置三个平行副本使用SYBR Green 实时PCR 试剂盒进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。qPCR 引物序列如下：RASSF8-AS1正向引物5′-CAAAGGGTGACACACCAGGA-3′，反向引物5′-TGGTGATCAACACAAACTGGA-3′；
RASSF8正向引物5′-AAGTATGGGTGGATGGAGTTCAG-3′，反向引物5′-ATGAGGTGCTAAGTGTCTTTCAG-3′；
内参GAPDH正向引物5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′ 和反向5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。
1.4 RASSF8-AS1 表达与临床病理特征的联系与共表达分析
利用R 语言ggboxplot 命令分析RASSF8-AS1与胃癌患者年龄、性别、临床分期、TNM 分期等临床特征的关系，同时进行共表达分析，评估RASSF8-AS1与RASSF8之间的相关性。
1.5 GO 和KEGG 富集分析
对RASSF8-AS1及其靶基因RASSF8进行GO和KEGG 分析，确定RASSF8-AS1在胃癌发生发展中参与的信号通路。
1.6 统计学方法
使用R4.0.2 软件和Graphpad Prism 8.064 软件进行统计学分析。计数资料以n（%）表示；
将患者的年龄、性别、TNM 分期等临床指标进行量化赋值。生存分析采用KM 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 筛选目的eRNA
提取表达数据中胃癌相关的eRNA 表达量，通过生存分析筛选（P＜0.05）和相关性筛选（相关系数＞0.4，P＜0.05），共鉴定出28 对eRNA-靶基因，部分eRNA-靶基因见表1。根据与生存相关的显著性排序且除去已有研究的eRNA 基因后选定RASSF8-AS1为目的基因进一步分析。
表1 部分生存相关的eRNAs 及其靶基因Table 1 Survival-associated eRNAs and their predicted target
2.2 RASSF8-AS1 表达水平与临床病理特征的关系
RASSF8-AS1的表达水平与胃癌患者的年龄、临床分级、临床分期、肿瘤大小显著相关，见图1。其中，年龄≤65 岁的患者中RASSF8-AS1的表达水平显著高于年龄＞65 岁的患者，差异有统计学意义（χ2=4.356，P＜0.05），见图1A；
G3期患者RASSF8-AS1的表达量显著高于G2 期患者，差异有统计学意义（χ2=4.166，P＜0.05），见图1B；
临床I 期患者RASSF8-AS1的表达量与Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者比较显著减少，差异有统计学意义（χ2=6.452，P＜0.05），见图1C；
T1 期患者RASSF8-AS1的表达水平显著低于T2 期、T3 期、T4 期患者，差异有统计学意义（χ2=6.466，P＜0.05），见图1D。RASSF8-AS1在不同的N 分期患者、M 分期患者中的表达量差异并不明显，见图1E 和1F。
图1 RASSF8-AS1 表达量与肺腺癌患者临床病理特征相关性分析Figure 1 Correlation analysis between RASSF8-AS1 expression and clinicopathological characteristics of lung adenocarcinoma patients
2.3 RT-qPCR 法测定RASSF8-AS1 和RASSF8 水平
采用逆转录聚合酶链式反应（Real Time Quantitative PCR，RT-qPCR）检测人正常胃粘膜上皮细胞GES-1 和胃癌细胞AGS 中RASSF8-AS1和RASSF8的表达水平。与正常细胞相比，胃癌细胞中RASSF8-AS1和RASSF8的表达水平显著降低，差异有统计学意义（HR=0.044，95%CI：0.032～0.056，P＜0.05）。见图2。
图2 RT-qPCR 法测定RASSF8-AS1 和RASSF8 水平Figure 2 RASSF8-AS1 and RASSF8 levels were determined by RT-qPCR
2.4 RASSF8-AS1 在胃癌中的预后价值及共表达分析
利用Kaplan-Meier 法分析高低表达组总体生存率的差异，高表达RASSF8-AS1的患者总体生存率低于低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）见图3A。RASSF8-AS1与其靶基因RASSF8的相关系数为0.88（R=0.88，P＜0.05）。见图3B。
图3 RASSF8-AS1 在胃癌中的预后价值及共表达分析Figure 3 Prognostic value and co-expression analysis of RASSF8-AS1 in stomach adenocarcinoma
2.5 GO 和KEGG 富集分析
通过GO 和KEGG 富集分析进一步了解RASSF8-AS1在胃癌发生发展过程中参与的信号通路，GO 结果表明，RASSF8-AS1参与了多种生物过程，包括细胞外基质组织、细胞黏附、化学突触传递的调节、胶原代谢等。KEGG 通路分析中，间质发展、细胞外基质组织、膜电位的调节等信号途径被富集。见图4。
图4 功能富集分析Figure 4 Functional enrichment analysis
胃癌是全球第五大常见癌症，通常在内镜活检后进行组织学诊断，并使用CT、内镜超声、PET和腹腔镜进行分期［10］。早期胃癌的主要治疗方法是内镜切除，非早期可手术的胃癌采用手术治疗，晚期胃癌的治疗主要采用化疗，中位生存期小于1年。由于胃癌往往处于诊断的晚期，其死亡率很高，使其成为癌症相关死亡的第三大常见原因［11-12］。近年来，越来越多的证据表明，eRNA 的失调与癌症的发生发展密切相关，如eRNATBX5-AS1可能是肺腺癌独立预后较差的生物标志物候选基因，并与靶基因TBX5呈正相关［13］。本研究探索了与胃癌预后相关的eRNA，发现RASSF8-AS1与胃癌的临床病理特征、患者的总体生存期等显著相关，可能作为潜在的治疗靶点。
本研究利用PreSTIGE算法与Kaplan-Meier生存分析和相关性分析筛选出增强子RASSF8-AS1。通过RT-qPCR 检测发现与胃正常黏膜上皮细胞相比，RASSF8-AS1和RASSF8在胃癌细胞中表达水平明显下调。此外，RASSF8-AS1与胃癌患者的年龄、临床分级、临床分期、肿瘤大小显著相关。因此，RASSF8-AS1的表达水平可能作为区分临床Ⅰ期患者、T1 期患者的潜在标志物。Kaplan-Meier 生存分析显示，RASSF8-AS1表达上调与总体生存率较差显著相关，RASSF8-AS1表达增多可作为预后不良的生物标志物。
反义RNA 分子是一种独特的DNA 转录物，由19～23 个核苷酸组成，与mRNA 互补。反义RNA在基因复制、转录和翻译等多个层面调控基因表达中起着至关重要的作用。多项研究表明，反义RNA 的异常表达可以作为癌症诊断的指标。例如Iorio 等［14］发现15 种miRNAs 的表达水平在正常组织和癌组织之间存在显著差异。反义RNA 还可以作为癌症促进基因，如miR-21、miR-155、miR-17-20和癌症抑制基因，如miR-15、miR-16、miR-143［15］。RASSF8-AS1是RASSF8的反义RNA，共表达分析显示，RASSF8-AS1与RASSF8显示出明显的正相关性。Ras 相关结构域家族（RASSF）的成员参与多种关键活动，如细胞增殖、微管稳定性、凋亡、启动子甲基化和囊泡运输。RASSF8被认为是肺癌和宫颈癌中潜在的肿瘤抑制因子，本研究发现RASSF8-AS1在胃癌中表达下调，可能影响RASSF8的表达，进一步对胃癌的发生发展产生重要作用。
通过基因富集分析，探究RASSF8-AS1影响胃癌发生发展的机制。GO 结果表明，RASSF8-AS1参与了多种生物过程，包括细胞外基质组织、细胞黏附、化学突触传递的调节、胶原代谢等。细胞与细胞的相互作用和细胞粘附是癌症进展的关键介质，促进了癌症的特征，包括免疫逃避和转移性扩散。肿瘤微环境中许多细胞粘附分子发生改变，糖基化发生显著改变。细胞粘附分子的这些变化改变了肿瘤细胞与其他细胞和细胞外基质蛋白相互作用的能力［16］。此外，KEGG 通路分析中，间质发展、细胞外基质组织、膜电位的调节等信号途径被富集。这些生物过程及信号通路是调节细胞骨架、间隙连接和连接子复合物、基底外侧膜和肌动蛋白细胞骨架以及细胞外泌体的重要通路，这表明RASSF8-AS1影响肿瘤细胞的侵袭性生长［17］。
综上所述，本研究证明了RASSF8-AS1是胃癌中关键的生存相关的eRNA，并且与胃癌的发生发展及预后密切相关，可能成为胃癌患者早期诊断的潜在生物标志物和潜在的治疗靶点。
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